Welche Rolle spielen ROS1 und NTRK in der Onkologie?

ROS1 ist ein Gen, das für ein Protein kodiert, welches als Rezeptor-Tyrosinkinase fungiert. Dieses Protein spielt eine wichtige Rolle in der Zellkommunikation und
-regulation, insbesondere in Bezug auf Zellwachstum und -differenzierung. In der Onkologie ist ROS1 von besonderem Interesse, da es bei verschiedenen Krebsarten genetische Veränderungen, sogenannte Translokationen, aufweisen kann. Diese führen zur Bildung von abnormen Proteinen, die zur dauerhaften Aktivierung verschiedener Signalwege führen und so das Zellwachstum unkontrolliert fördern kann. Diese abnormen Proteine sind oft treibende Faktoren bei der Entstehung und dem Fortschreiten bestimmter Krebsarten. Der ROS1-Signalweg ist daher ein wichtiger therapeutischer Ansatzpunkt in der Krebsbehandlung.

ROS1-Fusionen entstehen, wenn das ROS1-Gen mit einem anderen Gen zusammengeführt wird. Dies führt zur Bildung eines Fusionsproteins, das eine unregulierte Tyrosinkinase-Aktivität aufweist. Diese unkontrollierte Aktivität kann das Zellwachstum und die Zellteilung fördern, was zur Tumorbildung führt. Bekannte ROS1-Fusionspartner sind unter anderem CD74, SLC34A2, EZR, und SDC4.Li S, Zhang He, Chen T, et al. Current treatment and novel insights regarding ROS1‐targeted therapy in malignant tumors. Cancer Med. 2024;13(8): e7201. doi: 10.1002/cam4.7201. Ou, SI, Nagasaka M. A Catalog of 5’ Fusion Partners in ROS1-Positive NSCLC Circa 2020. JTO Clin Res Rep 2020;1(3). doi: 10.1016/j.jtocrr.2020.100048.

NTRK steht für die Neurotrophe Tyrosin-Rezeptor-Kinase, zu denen NTRK1, NTRK2 und NTRK3 gehören. In der Onkologie spielt NTRK wie ROS1 eine wichtige Rolle, da es ebenso Fusionen mit anderen Genen bilden kann. Diese weisen eine konstitutiv aktive Tyrosinkinase-Aktivität auf und können so zu unkontrolliertem Zellwachstum und Tumorbildung führen. Beispielhafte NTRK-Fusionen sind folgende:

• NTRK1-Fusionen: LMNA, TPM3 und TPR
• NTRK2-Fusionen: TRIM24, PAN3 und SQSTM1
• NTRK3-Fusionen: TPM4, TFG und MYO5ACocco E, Scaltriti M, Drilon A. NTRK fusion-positive cancers and TRK inhibitor therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2018;15: 731–747. doi:10.1038/s41571-018-0113-0. 

Die häufigsten Tumore und Häufigkeiten – ROS1

ROS1-Fusionen sind am häufigsten beim nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) zu finden, insbesondere bei Adenokarzinomen. Etwa 1-2% der NSCLC-Patienten weisen ROS1-Fusionen auf. Diese genetische Veränderung kann jedoch auch in anderen Tumorarten vorkommen, wie z.B. im Glioblastom, Cholangiokarzinom und einigen seltenen Weichteilsarkomen (aber auch Magen-, Eierstockkrebs).Drilon A, Jenkins C, Iyer S. et al. ROS1-dependent cancers — biology, diagnostics and therapeutics. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:35–55. doi: 10.1038/s41571-020-0408-9.

Die häufigsten Tumore und Häufigkeiten – NTRK

NTRK-Genfusionen sind selten und machen insgesamt weniger als 1% der Karzinome aus. Sie kommen dafür aber in einer Vielzahl von Tumorarten vor, sowohl bei soliden Tumoren als auch bei hämatologischen Malignitäten. Zu den Tumorarten, in denen NTRK-Genfusionen häufiger auftreten, gehören kindliche Tumore (z.B. kongenitales fibrosarkomatöses infantiles Fibrosarkom und sekretorisches Brustkarzinom) und das papilläre Schilddrüsenkarzinom. Seltener sind NTRK-Fusionen bei Tumorarten wie beispielsweise Lungenkrebs, Kolorektalkarzinom und Glioblastom.O’Haire S, Franchini F, Kang YJ, et al. Systematic review of NTRK 1/2/3 fusion prevalence pan-cancer and across solid tumours. Sci Rep. 2023;13:4116 (2023). doi: 10.1038/s41598-023-31055-3. Joshi SK, Davare MA., Druker BJ, et al. Revisiting NTRKs as an emerging oncogene in hematological malignancies. Leukemia. 2019;33:2563–2574. doi: 10.1038/s41375-019-0576-8.

Sowohl ROS1- als auch NTRK-Alterationen haben eine prädiktive Rolle, da sie anzeigen können, ob ein Patient auf bestimmte zielgerichtete Therapien, wie Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs), ansprechen kann. Aus diesem Grund ist eine Testung von essenzieller Bedeutung und wird vor allem im NSCLC in mehreren nationalen und internationalen Leitlinien empfohlen. Die European Society for Medical Oncology (ESMO) und die S3-Leitlinie in Deutschland empfehlen allesamt die Testung auf ROS1 und NTRK bei allen Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC.Hendriks LE, Kerr KM, Menis J. et al. Oncogene-addicted metastatic non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical Practice Guideline for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2023; 34(4):339-357. doi: 10.1016/j.annonc.2022.12.009. Leitlinienprogramm Onkologie (Deutsche Krebsgesellschaft, Deutsche Krebshilfe, AWMF): S3-Leitlinie Prävention, Diagnostik, Therapie und Nachsorge des Lungenkarzinoms, Langversion 3.0, 2024, AWMF-Registernummer: 020-007OL https://www.leitlinienprogramm-onkologie.de/leitlinien/lungenkarzinom/. Abgerufen am 20.08.2024.

Die Testung auf ROS1- und NTRK-Alterationen ist aufgrund der Komplexität verschiedener Fusionspartner nicht trivial und es stehen mehrere Methoden zur Verfügung. Hierbei sind die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), die Immunhistochemie (IHC), und das Next Generation Sequencing (NGS) die üblichen Methoden zur Bestimmung einer ROS1-Fusion. NTRK kann ebenfalls mit diesen Methoden nachgewiesen werden, aufgrund der Seltenheit erfolgt dies allerdings meistens mit NGS.Stenzinger A, van Tilburg CM, Tabatabai G, et al. Diagnostik und Therapie von Tumoren mit NTRK-Genfusionen. Pathologe. 2021;42:103–115. doi: 10.1007/s00292-020-00864-y

1. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH):

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine molekularbiologische Technik, die verwendet wird, um spezifische DNA-Sequenzen in Chromosomen zu lokalisieren. Diese Methode nutzt fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden, die an komplementäre DNA-Sequenzen binden, um genetische Veränderungen wie Deletionen, Duplikationen, Translokationen und Fusionen zu identifizieren. Hierbei werden folgende 4 Schritte durchgeführt:

1. Probenvorbereitung: Zellen oder Gewebeproben werden auf einem Objektträger fixiert und die DNA wird denaturiert, um die Doppelhelix in Einzelstränge zu trennen.
2. Sondenhybridisierung: Fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden, die komplementär zu den Zielsequenzen sind, werden auf die denaturierte DNA aufgebracht. Diese Sonden binden spezifisch an ihre Zielsequenzen durch Paarung der Basen.
3. Waschen und Detektion: Nach der Hybridisierung werden überschüssige Sonden durch Waschen entfernt. Die gebundenen Sonden bleiben an den Zielsequenzen haften und können mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden.
4. Mikroskopische Analyse: Die Proben werden unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Laser angeregt. Die Sonden emittieren daraufhin Licht in Form von Fluoreszenz, welches detektiert und visualisiert werden kann. Dies ermöglicht die Identifizierung und Lokalisierung der Ziel-DNA-Sequenzen.Chrzanowska NM, Kowalewski J, Lewandowska MA. Use of Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) in Diagnosis and Tailored Therapies in Solid Tumors. Molecules. 2020; 25(8): 1864. doi: 10.3390/molecules25081864

2. Immunhistochemie (IHC):

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine labortechnische Methode, die verwendet wird, um spezifische Proteine in Gewebeproben zu identifizieren und zu visualisieren. Diese Technik nutzt Antikörper, die spezifisch an das Zielprotein binden, und ermöglicht so die Lokalisierung und Quantifizierung von Proteinen in Zellen und Geweben. Diese Methode kann als Screening-Test verwendet werden, um eine ROS1-Proteinexpression nachzuweisen und sollte mit einer weiteren Methode (z.B. NGS oder FISH) bestätigt werden. Eine detailliertere Beschreibung zur IHC finden Sie unter „Wie wird PD-L1 in Tumorgewebe immunhistochemisch nachgewiesen“. 

3. Next-Generation Sequencing (NGS):

Next-Generation Sequencing (NGS) ist eine fortschrittliche Sequenzierungstechnologie, die es ermöglicht, die Nukleotidsequenz von DNA oder RNA schnell und kosteneffizient zu bestimmen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Sanger-Sequenzierungsmethoden kann NGS Millionen von DNA-Fragmenten parallel sequenzieren, was zu einer erheblichen Steigerung der Datenmenge und Geschwindigkeit führt. Inzwischen gilt NGS als Sammelbezeichnung für eine Vielzahl verschiedener Technologien, um diese Sequenzierung durchzuführen.

Bei einer häufig verwendeten Methode werden DNA-Fragmente mit sogenannten Adaptern markiert, sodass die Fragmente an der vorgefertigten Flowcell (Sequenzierungsreaktorgefäß bestehend aus einem Glasobjektträger mit immobilisierten Oligonukleotiden) binden können. Die DNA-Fragmente bilden dann Brücken, da die anderen Enden der DNA-Fragmente an die Primer binden und somit ebenfalls an der Flowcell gebunden sind. Im Rahmen der Polymerasekettenreaktion (PCR) werden die DNA-Fragmente vervielfältigt. Dieser Prozess wiederholt sich mehrfach, sodass sich Cluster bilden, die sequenziert werden können. Mit der Erkennung der einzelnen Basen können verschiedene Alterationen innerhalb der DNA bestimmt werden.Hu T, Chitnis N, Monos D, et al. Next-generation sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 2021;82(11):801-811. doi: 10.1016/j.humimm.2021.02.012.